|
|
Molekulární detekce původců cerkáriové dermatitidy
Procházka, Jan ; Leontovyč, Roman (vedoucí práce) ; Baláž, Vojtech (oponent)
Lidská cerkáriová dermatitida je svědivé kožní onemocnění způsobované larválními stádii ptačích motolic, v ČR nejčastěji způsobované rodem Trichobilharzia. Monitoring jejich výskytu je od roku 2021 součástí povinného sledování kvality koupacích vod. Oficiálně používanou metodou detekce je sběr a vyšetřování vodních plžů. Tato metoda má však mnoho nevýhod v podobě vysoké časové náročnosti, nízké citlivosti a obtížné determinace parazitů. Alternativu by mohly poskytnout molekulární metody založené na filtraci environmentální DNA (eDNA) společně s metodami izotermální amplifikace, a to díky jejich nižším časovým nárokům, vysoké citlivosti a přesné determinaci. Cílem této práce bylo vytvořit metodu detekce původců cerkáriové dermatitidy založenou na izotermální amplifikaci cLAMP a filtraci eDNA z vody. Za tímto účelem byla pomocí molekulární analýzy vybrána konzervovaná sekvence pro rod Trichobilharzia, na jejímž základě byla navržena sada primerů pro cLAMP. Bylo potvrzeno, že navržená esej specificky amplifikuje DNA minimálně čtyř druhů rodu Trichobilharzia. Na základě laboratorních pokusů byla potvrzena dostatečná senzitivita eseje pro použití při detekci eDNA, a to jak na ředících řadách DNA, tak v kombinaci s filtrací eDNA živých cerkárií z vody. Po pokusech v laboratorních podmínkách byla esej...
|
|
|
The skin immune response of mice infected with avian schistosomes
Revalová, Alena ; Macháček, Tomáš (vedoucí práce) ; Kolářová, Libuše (oponent)
Invázia kože cicavcov cerkáriami vtáčích schistosom rodu Trichobilharzia vedie k vzniku kožnej patológie nazývanej cerkáriová dermatitída (CD). Hoci výskyt kožných prejavov CD, ako sú makuly, papuly a pruritus, je zvyčajne spájaný s predošlou senzitizáciou infikovaného jedinca, len ojedinele sa zohľadňuje konkrétna infekčná dávka či špecifický pôvodca CD. V tejto práci sme preto skúmali imunitnú odpoveď v koži a to v ušniciach myší infikovaných cerkáriami rodu Trichobilharzia - konkrétne druhmi T. regenti alebo T. szidati - za použitia infekčných dávok 100, 1000 alebo 4x100 cerkárií. Pre komplexné porovnanie týchto faktorov sme zvolili využitie kombnáciu in vivo a in vitro metód. Na sledovanie histopatologických zmien ušníc bola využitá klasická histológia a na identifikáciu leukocytov v tkanive prietoková cytometria. Zo séra myší sme detekovali cytokíny a špecifické protilátky voči parazitárnym antigénom a lokálna produkcia cytokínov v koži bola detekovaná z in vitro kultivácie ušníc. Naše výsledky preukázali výrazný vplyv infekčnej dávky na priebeh imunitnej odpovede a to ako aj na úrovni lokálnej, tak aj systémovej reakcie. Nízka infekčná dávkou (100 cerkárií) vyvolala len slabú imunitnú odpoveď, ktorá bola takmer nedetekovateľná použitými metódami. Naopak, infekcia 1000 cerkáriami viedla k v...
|
|
|
Molecular and serologic diagnosis of infections caused by Trichobilharzia
Vaščiková, Michaela ; Horák, Petr (vedoucí práce) ; Ditrich, Oleg (oponent)
Cerkárie rodu Trichobilharzia penetrujú nie len do kože definitívneho hostiteľa (vodné vtáctvo), ale aj do kože náhodných hostiteľov (cicavce). Dôsledkom penetrácie je vznik hypersenzitívnej reakcie nazývanej cerkáriová dermatitída. Cieľom práce bolo detegovať parazitárnu DNA zo séra a mozgomiešneho moku infikovaných kačiek, tiež zo séra infikovaných myší. Pomocou PCR s primermi pre tandemovo repetitívnu sekvenciu sme boli schopní zachytiť 1 fg parazitárnej DNA izolovanej zo séra infikovaných kačiek. Parazitárnu DNA sa nám podarilo amplifikovať iba u 16 vzoriek séra a likvoru kačiek, ale nie zo sér myší. Ďalej boli myšie séra testované ELISA a Western blot metódou, a to za použitia antigénu homogenátu cerkárií T. regenti (TRhc) , T. szidati (TShc) a S. mansoni (SMhc). Výsledky ukazujú na progesívny nárast hladiny IgM protilátok, ktorý bol viditeľný od 10 dní prvej infekcie a nárast hladiny IgG protilátok až od druhej reinfekce. Po 10 dňoch od štvrtej reinfekcie hladina oboch protilátok v sére postupne klesala, ale ešte 100 dní od štvrtej reinfekcie bola hladina protilátok vyššia ako u negatívnych sér. Výsledky z Western blotu ukazujú, že IgG a IgM protilátky v homológnom sére rozpoznávali antigény 21 a 22 kDa z TRhc. V homológnom sére IgG protilátky rozpoznávali antigén 26 kDa z TShc a IgM...
|
|
|
Odvrhování glykokalyxu u cerkárií ptačích schistosom
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Štěrba, Ján (oponent)
Trichobilharzia spp. jsou ptačí schistosomy příbuzné lékařsky významným lidským parazitům rodu Schistosoma. Penetrující cerkárie jsou dobře známy jako kauzativní agens cerkáriové dermatitidy u lidí. Cerkárie aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomula. Tomuto procesu předchází odhození ocásku, dochází k vyprázdnění penetračních žláz a rozsáhlým povrchovým změnám. Jednou z těchto změn je ztráta vysoce imunogenního glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. O mechanismu jeho odvrhování je poměrně málo informací. Hypotézy jsou založeny na nepřímých důkazech, které navrhují účast peptidáz nebo (fosfo)lipáz z penetračních žláz. Tato práce popisuje změny v povrchové glykosylaci během transformace cerkárií na schistosomula pomocí fluorescenčně značených lektinů a monoklonálních protilátek proti Lewis X antigenu. Lektiny UEA-I, LTA a PNA byly zvoleny jako markery transformace u T. regenti. Dále se tato práce zabývá odvrhováním glykokalyxu cerkárií. Při indukci in vitro vyprazdňování penetračních žláz a značení obsahu žláz jsme pozorovali silnou vazbu sekretů z cirkum- a postacetabulárních žláz na povrch cerkárií T. szidati a...
|
|
|
Vlastnosti a funkce glykokalyxu cerkárií motolic
Chaloupecká, Jana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent)
Motolice jsou parazité z kmene Platyhelminthes, kteří mají složité vývojové cykly zahrnující dva až čtyři hostitele. Tato práce se zaměřuje především na motolice čeledi Schistosomatidae. Jejich cerkárie, které opouštějí mezihostitelského plže, aktivně penetrují kůží definitivního hostitele a transformují se na schistosomuly. Proces transformace doprovází odhození ocásku a vyprázdnění penetračních žláz cerkárií. Během transformace prochází tělo cerkárie četnými ultrastrukturálními a molekulárními změnami. Jednou z těchto změn je ztráta povrchového glykokalyxu, který představuje ochrannou vrstvu ve vodním prostředí. Na jeho odvrhování se pravděpodobně podílí proteolytické enzymy z penetračních žláz cerkárií během průniku parazita do hostitele. Glykokalyx má specifické složení sacharidových molekul, které jsou vázány k lipidům nebo proteinům membrány tegumentu. Tato práce popisuje vznik, ultrastrukturu, sacharidové složení, funkce a mechanizmus odvrhování glykokalyxu cerkárií.
|
|
|
Charakterizace rekombinantních cathepsinů B ptačí schistosomy Trichobilharzia regenti
Dvořáková, Hana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Tato studie se zabývá rekombinantními cysteinovými peptidázami - cathepsiny B - původem z ptačí schistosomy Trichobilharzia regenti, která je jedinečná v rámci celé čeledě pro svoji schopnost migrovat nervovou tkání až do míst konečné lokalizace. Peptidázy napomáhají invazi tohoto parazita do hostitele, migraci ve tkáni, degradaci hostitelských proteinů a pravděpodobně také úniku před hostitelským imunitním systémem. Tato práce navazuje na výzkum prováděný pracovníky Katedry parazitologie Přírodovědecké fakulty Karlovy Univerzity a měla za cíl prohloubit charakteristiku rekombinantních cathepsinů B původem z T. regenti. U T. regenti byly již dříve charakterizovány 2 cysteinové peptidázy cathepsin B1 (TrCB1) a cathepsin B2 (TrCB2). TrCB1 je lokalizován ve střevě schistosomul a je pravděpodobně zodpovědný za trávení. TrCB2 byl nalezen v postacetabulárních žlázách cerkárií a zřejmě napomáhá při penetraci. Rekombinantní pro-cathepsiny B (izoformy TrCB1.1 a TrCB1.4 a dále TrCB2) byly získány expresí v systému P. pastoris. Byl rovněž proveden pokus o produkci rekombinantní izoformy TrCB1.6, jehož cystein aktivního místa je nahrazen glycinem, v kvasinkovém systému Pichia pastoris. Zatímco TrCB2 byl schopen se sám aktivovat za podmínek expresního media, TrCB1.1 a TrC1.4 zymogeny byly efektivně aktivovány...
|
|
|
Molekulární diagnostika ptačích schistosom při nákaze přirozených i náhodných hostitelů
Šteiger, Vladimír ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Ptačí schistosomy rodu Trichobilharzia patří mezi významné původce kožní hypersenzitivní reakce zvané cerkáriová dermatitida. Tito parazité využívají jako mezihostitele plicnaté plže z čeledi Lymnaeidae, a jako definitivní hostitele především kachnovité ptáky. První larvální stádium, miracidium, ve vodě aktivně vyhledává a penetruje mezihostitelského plže, ve kterém se vyvíjí v mateřskou sporocystu. Vytvářejí se dceřiné sporocysty migrující do hepatopankreatu plže, kde dochází k asexuální produkci velkého množství cerkárií. Ve vodním prostředí cerkárie opouští mezihostitele, aktivně vyhledávají a penetrují do kůže definitivního hostitele. V jeho těle dospívají a produkují vajíčka. Cerkárie však mohou penetrovat do kůže savců, včetně člověka, kde dochází k jejich rychlé eliminaci imunitním systémem za vzniku zánětlivé reakce. Dosud neexistuje spolehlivá metoda, která by u lidí byla schopná odlišit cerkáriovou dermatitidu od jiných hypersenzitivních kožních reakcí a zároveň pomocí které by bylo možné spolehlivě diagnostikovat trichobilharziózu u kachen. Hlavním cílem této práce bylo, za použití molekulárních metod diagnostikovat nákazu ptačími motolicemi u experimentálně nakažených přirozených (kachen) i náhodných hostitelů (myší, lidí). Za účelem optimalizace experimentů byla pomocí konvenční PCR...
|
|
| |
|
|
Influence of bird schistosome Trichobilharzia regenti on haemocyte activity of lymnaeid snails
Skála, Vladimír
Plži (Gastropoda) jsou ve svém přirozeném prostředí exponováni různým patogenům, a to například bakteriím nebo mnohobuněčným parazitům (digenetickým motolicím), které se v plžích vyvíjejí. V boji proti těmto patogenům využívají plži sofistikovaný vnitřní obranný systém, který je tvořen humorální a buněčnou složkou. Lektiny jsou považovány za nejdůležitější humorální komponenty, zatímco hemocyty představují nejvýznamnější efektorové buňky. Imunita je jeden z důležitých faktorů podmiňujících kompatibilitu/nekompatibilitu plžů a patogenů (zejména plžů a motolic). Úvod této dizertační práce zahrnuje přehled literatury o imunitním systému plžů a jeho reakcích proti patogenům, a to bakteriím a motolicím. Zároveň jsou v této části shrnuty i poznatky o imunomodulacích způsobených kompatibilními motolicemi. Experimentální práce (prezentována v přiložených publikacích) se zaměřila zejména na vliv ptačí schistosomy Trichobilharzia regenti na aktivitu hemocytů dvou druhů plovatkovitých plžů: (i) Radix lagotis, v němž se T. regenti vyvíjí a (ii) Lymnaea stagnalis, který je k infekci rezistentní. Tento parazit způsobuje neuromotorické poruchy u specifických defnitivních hostitelů (vodních ptáků), ale náhodně může infikovat i člověka a způsobovat tzv. cerkáriovou dermatitidu. Originální publikace zahrnují...
|
|
|
Analysis of secretome from Trichobilharzia regenti cercariae and characterisation of selected peptidases
Konečný, Lukáš ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent)
(česky): Motolice Trichobilharzia regenti je neurotropní parazit ptáků z rodiny Schistosomatidae. Cerkárie, invazivní stadium těchto motolic, využívají k aktivní penetraci hostitele exkrečně-sekreční produkty, které obsahují proteolytické enzymy schopné narušit tkáně hostitele zaručit tak úspěšný přenos. Nejvíce zastoupeným enzymem zodpovědným za penetraci cerkárií lidské schistosomy S. mansoni je cerkáriová elastáza. Tato serinová peptidáza je dobře známá pro degradaci kožních proteinů jako je elastin, keratin, kolagen nebo laminin, avšak, aktivní exprese ortologu tohoto enzymu nebyla u rodu Trichobilharzia nikdy prokázána. Z tohoto důvodu panovalo pevné přesvědčení, že cerkárie T. regenti používá k invazi hostitele zejména cysteinové peptidázy, zvláště katepsiny, které byly opakovaně identifikovány v tomto životním stádiu. Abychom posílili tuto hypotézu. inkubovali jsme cerkárie T. regenti v sestavě využívající kachní kůži jakožto stimulant pro vyprázdnění penetračních žláz. Získané ESPs byly analyzovány hmotnostní spektrometrií a poprvé se nám tak podařilo identifikovat proteinovou formu cerkáriové elastázy T. regenti. Produkce aktivního rekombinantního proteinu se bohužel nezdařila v bakteriálním ani kvasinkovém expresním systému, nicméně, naše sekretomická studie společně s dodatečnou qPCR...
|
host ::
RSS.